هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان

   هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان

                   مروري بر روشهاي اندازه‌گيري و محدوديتهاي آزمایشگاهی

هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان كه در حاملگي به مقدار زياد از جفت ترشح مي‌شود، در خون و ادرار مردان و زنان غير باردار نيز يافت مي‌شود. اين هورمون بطور طبيعي بصورت هترودايمري متشكل از يك زنجيره آلفا و يك زنجيره بتا است.علاوه بر هورمون كامل، زنجيره هاي منفرد و نيز محصولات حاصل از تجزية آنزيمي اين تركيب در بدن وجود دارند. رايج ترين روش اندازه گيري هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان، روشهاي سنجش ايمني است. احتمال تداخل قطعات ناشي از تجزيه اين هورمون و نيز زنجيره‌هاي منفرد آن، در روشهاي اندازه‌گيري وجود دارد. به همين لحاظ طراحي و ساخت كيتهائي كه بطور اختصاصي عمل كنند ضروري و حائز اهميت است. سنجش هاي ايمني موجود عمدتاَ براي زنجيرة بتاي اين هورمون اختصاصي بوده و جهت استفاده در سرم ساخته شده اند. امروزه بيش از صد نوع كيت مختلف براي سنجش هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان طراحي شده و در دسترس مي‌باشند .بنابراين جاي تعجب نخواهد بود كه بر حسب نوع كيت بكار رفته پاسخهاي متفاوتي از يك نمونه ثابت كسب شود. اختلاف بين اين جواب ها مي تواند بيش از صددرصد باشد و در ضمن اين تفاوت در مواردي مانند جنين مبتلا به سندرم داون ،آنوپلوئيدي، پره‌اكلامپسي، سقط هاي خودبخود، سرطان بيضه و بيماريهاي تروفوبلاستي بسيار شديدتر مي‌باشد.

مقدار هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان كه از لحاظ بيولوژيك فعال است، در سه ماهة اول بارداري بصورت لگاريتمي افزايش مي‌يابد بطوريكه در هر 48 ساعت مقدار آن دوبرابر مي‌شود. ميزان اين هورمون در هفتة دهم بارداري به ماكزيمم مقدار خود مي رسد. اين مقدار از هفتة دهم تا شانزدهم به يك‌پنجم ماكزيمم خودرسيده، تا پايان زمان بارداري ثابت باقي مي‌ماند. هورمون كامل و متابوليتهاي آن در سرم و ادرار وجود داشته و قابل اندازه‌گيري هستند.

پايداري انواع متابوليتهاي هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان

هورمون كامل گنادوتروفين جفتي‌ انسان بيشترين پايداري را دارد. اين هورمون در سرم يا خون استريل در دماي 37 درجه نيمه عمري در حدود 700 ساعت دارد. (بعضي پايداري آن را در حدود 8 هفته ويا 1300 ساعت مي دانند). در اين شرائط مقدار هورمون كامل در هر هفته تقريباَ 14% كاهش مي‌يابد. با كاهش دما طول عمر  هورمون چندان تغييري    نمي كند. از آنجائيكه هورمون كامل تا حدودي شكسته شده و نيز به زيرواحدهاي خود تجزيه مي‌شود، مقدار زيرواحدهاي آزاد و نيز هورمون شكسته شده با گذشت زمان افزايش مي‌يابد. برخي از كيتها هورمون كامل  گنادوتروفين جفتي‌ و زيرواحد بتاي آزاد را با هم اندازه‌گيري مي كنند. در اين موارد  اعداد  حاصل  از اندازه‌گيري تفاوت چنداني نمي‌كند. استفاده از روشهائي كه زنجيرة آزاد را اندازه‌گيري مي كنند سبب مي‌شود كه پس از مدت يك هفته حتي در دماي يخچال ميزان اين تركيبات 20 تا 30 درصد افزايش يابد. با توجه به پايداري قطعة مركزي بتا، پس از يك هفته تقريباَ ميزان آن ثابت باقي مي ماند.

روشهاي اندازه گيري هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان

تست بارداري يكي از رايج‌ترين تستهاي آزمايشگاهي است، اغلب تصور مي‌شود كه در اين آزمونها ملكول كامل گنادوتروپين جفتي انسان و يا زنجيرة بتاي آن اندازه گيري مي شود، در حاليكه در اكثر كيتهاي تجارتي طيف وسيعي از ملكولهاي وابسته به گنادوتروپين جفتي انسان در خون يا ادرار مورد سنجش قرار مي گيرند. اين ملكولها مي توانند ملكول سالم گنادوتروپين جفتي ، گنادوتروپين غير طبيعي و يا محصولات حاصل از تجزية آنها باشند. مهمترين فرم اين ملكولها عبارتند از : هورمون كامل وفعال گنادوتروفين جفتي‌ انسان، گنادوتروپين جفتي شكسته شده، گنادوتروپين جفتي پرقند، گنادوتروپين جفتي فاقد بخش انتهائي زنجيره بتا، زنجيره آزاد و سالم بتا، زنجيره آزاد و شكسته شدة بتا، قطعات مركزي زنجيره بتا.

از لحاظ كمي در زنان باردار گنادوتروپين جفتي كامل وسالم، بيشترين غلظت را در سرم دارا مي باشد. در ادرار اين افراد فرم غالب مربوط به قطعات مركزي بتا است.  البته در موارد خاصي گنادوتروپين جفتي شكسته شده، گنادوتروپين جفتي پرقند، گنادوتروپين جفتي بدون  سياليك اسيد و يا زنجيره آزاد بتا  بيشترين غلظت سرمي اين هورمون را تشكيل       مي دهد. اغلب كيتهاي تجارتي كه در آزمايشگاههاي باليني استفاده مي‌شوند، نمي‌توانند گنادوتروپين فاقد بخش انتهائي زنجيرة بتا، گنادوتروپين جفتي شكسته شده، زنجيره‌ آزاد بتا، گنادوتروپين جفتي پرقند و يا قطعات مركزي بتا را شناسائي كنند.  لذا مي‌توانند نتايج منفي  كاذب به  بار آورند. هرچند كه به دليل مذكور در بارداريهاي طبيعي اختلاف فاحشي در نمونه هاي سرمي مشاهده نمي‌شود اما در مواردي مانند بارداريهاي غيرطبيعي، سقط جنين، سندرم داون، مول هيداتيفرم و كوريوكارسينوما اين اختلاف بسيار فاحش است. خطاهاي فوق در سنجش گنادوتروپين جفتي انسان سبب تشخيص نادرست اختلالات تروفوبلاستي و تستهاي منفي كاذب بارداري مي‌شوند. آنتي‌باديهاي هتروفيل و يا آنتي‌باديهاي انساني بر عليه آنتي‌باديهاي موجود در كيتها سبب تداخل و پاسخهاي مثبت كاذب مي‌گردد. پاسخ هاي مثبت كاذب سبب تداخل در شناسائي بارداري هاي نابجا و يا كوريوكارسينوماي پس از بارداري مي‌شوند. برخي از بيماران فقط بدليل همين پاسخ هاي مثبت كاذب تحت شيمي درماني قرار گرفته و يا جراحي هاي بي مورد داشته‌اند. با دقت نظر در تهيه كيتها، استفاده صحيح و سنجشهاي چندگانه مي‌توان افراد غير باردار، مول هيداتيفرم و كوريوكارسينوما را بدرستي تشخيص داد. به هر حال موارد زير را همواره بايد در نظر داشت :

1 – سطح پايدار و بالاي گنادوتروپين جفتي در افراد غير باردار

2 – شناسائي گنادوتروپين جفتي انسان با منشا سرطاني

3 – شناسائي گنادوتروپين جفتي انسان با منشا تروفوبلاستي

4 – واكنشهاي متقاطع و مثبتهاي كاذب

5 – شناسائي گنادوتروپين جفتي انسان در خون و فقدان آن در ادرار

6 – شناسائي گنادوتروپين جفتي انسان در ادرار و فقدان آن در خون

7 – پاسخهاي منفي كاذب براي گنادوتروپين

8 – مقادير غير طبيعي بالا و يا پائين در بارداريهاي طبيعي

9 – پاكسازي آهسته گنادوتروپين پس از سقط و يا بارداري

10 – مقادير مرزي براي گنادوتروپين جفتي انسان در افرادي با سابقة بدخيمي و يا بيماريهاي تروفوبلاستي

به هر حال روشهاي مختلفي، اعم از سنجشهاي زيستي (بيواسي) و سنجشهاي ايمني (راديواكتيو) و خصوصاَ آنزيم دار جهت اندازه گيري اين هورمون طراحي شده و يا در دسترس مي‌باشند. اغلب اين روش ها بصورت ساندويچي بر روي سرم، پلاسما و يا ادرار انجام مي‌گيرد. در اين گروه سنجشها از دو آنتي‌بادي حيواني عليه دو شاخص آنتي‌ژنيك مولكول گونادوتروپين استفاده مي‌شود. معمولاَ يك آنتي بادي مونوكلونال موشي بر عليه يك جايگاه آنتي‌ژنيك در ساختمان اين هورمون و يك آنتي‌بادي مونوكلونال و يا پلي كلونال ديگر (از انواع گوسفندي، خرگوشي و يا بزي) بر عليه جايگاه دوم در ساختمان هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان استفاده مي‌شود. در بيشتر موارد يكي از اين آنتي‌بادي ها بر روي دانه هاي پلاستيكي، غشاء لوله و يا پليت تثبيت مي‌شوندكه به آنتي‌بادي گيرنده معروف هستند. آنتي‌بادي دوم كه به آنتي‌بادي ردياب معروف است، به ذرات رنگي، راديواكتيو، آنزيم، لومينسان و يا ساير شناساگرها متصل مي‌باشد. اغلب آنتي‌بادي دوم در فاز مايع است. نمونه مورد آزمايش يعني سرم، پلاسما و يا ادرار را به محيط آزمايش اضافه مي كنند. پس از زمان انكوباسيون، ملكول گنادوتروپين جفتي انسان در  يك و يا دو مرحله به هر دو  آنتي‌بادي  متصل مي‌شود. در اصل اين هورمون بين آنها به حالت ساندويچي درمي‌آيدو يا بين آنها مانند پلي، ارتباط برقرار مي‌كند. در واقع گنادوتروپين جفتي انسان بين دو آنتي‌بادي گيرنده و ردياب ساندويچ و آنتي‌بادي ردياب به شناساگري مثل آنزيم متصل مي باشد. پس از شستشو مواد اضافي موجود در نمونه و آنتي‌باديها ي ردياب مازاد از محيط خارج مي‌شوند و متناسب  با گنادوتروپين جفتي انسان كمپلكس ايمني نشاندار باقي مي‌ماند.

در تستهاي خانگي و يا قابل انجام در مطب از يك قطعة يكبار مصرف پلاستيكي استفاده مي‌شود، اين قطعه پلاستيكي يك پاية جاذب دارد كه در ادرار فروبرده شده و يا داراي جايگاهي براي قرار دادن چند قطره ادرار و يا سرم است. گنادوتروپين جفتي موجود در نمونه طبق خاصيت موئينگي از بخش جاذب حركت كرده و در مسير خود به آنتي‌بادي متصل به ذرات رنگي (طلاي كلوئيدي) متصل مي‌شود. اين مجموعه در فاز مايع حركت مي كند تا به جايگاهي مي‌رسد كه آنتي‌بادي گيرنده تثبيت شده است. حال كمپلكس ساندويچي توسط دو آنتي‌بادي گيرنده و ردياب، با مولكول گنادوتروپين جفتي  كامل مي شود. تشكيل لكه و يا نوار رنگي نشانة تشكيل ساندويچ و يا نشانة حضور گنادوتروپين جفتي انسان و يا مثبت بودن نتيجة آزمايش است. اين گونه تستها كيفي بوده و فقط فقدان و يا وجود در حد آستانة تشخيص را نشان    مي دهند و براي تعيين ميزان گنادوتروپين جفتي انسان به كار نمي روند .              

در آزمايشگاهها از روشهاي دستي يا دستگاهي كمي استفاده مي‌شود. در هردو روش آنتي‌بادي گيرنده در چاهك هاي ميكروپليت، لوله، دانه هاي پلاستيكي، غشاءها و يا هرنوع ديگري از فاز ساكن حامل تثبيت شده است. آنتي‌بادي ردياب نيز در فاز مايع در محيط بافري مناسب قرار دارد.  سرم يا پلاسما افزوده مي شود و گونادوتروپين  جفتي انسان دو مولكول آنتي‌بادي مذكور را به هم مي چسباند. در اصل ميزان آنتي‌بادي رديابي كه تثبيت مي شود به ميزان گنادوتروپين  جفتي  انسان در محيط بستگي دارد. حال بسته به نوع مولكول ردياب  با استفاده از دستگاه كالريمتر، فلوريمتر، لومينومتر و يا گاماكانتر ميزان ساندويچ و در واقع ميزان گنادوتروپين جفتي انسان شمارش مي شود. همانطور كه گفته شد حداقل پنجاه نوع كيت مختلف براي سنجش گنادوتروپين جفتي انسان در دسترس است. در اصل در هر نوع كيت از تركيب متفاوتي از    آنتي‌باديهاي گيرنده و ردياب استفاده شده است كه مي توانند يكي از دو اپي‌توپ را از ميان هشت اپي‌توپ مذكور بصورت ساندويچ درآورند.

مشكلات اندازه‌گيري گنادوتروپين جفتي انسان

يكي از مشكلات اين اندازه گيريها غيريكنواختي مولكول گنادوتروپين جفتي انسان فرمهاي غير طبيعي و محصولات تجزيه شدة آنها است كه اين امر سبب كسب پاسخهاي بسيار متفاوت در سنجشهاي گنادوتروپين جفتي انساندر نمونه هاي سرمي و يا ادراري مي‌شود. در واقع در كيت هائي با تركيب متفاوت از آنتي‌باديها، مولكولهاي متفاوتي از فرمهاي گنادوتروپين جفتي انسان شناسائي مي‌شوند. بعنوان مثال اگر  آنتي‌بادي  گيرنده بر عليه هورمون كامل گنادوتروپين جفتي انسان باشد و آنتي‌بادي ردياب ضد قطعات مركزي زنجيرة بتا باشد، گنادوتروپين جفتي  را بخوبي مي شناسد، در حاليكه گنادوتروپين جفتي شكسته شده را تشخيص نمي‌دهد. حداقل شش سيستم آنتي‌بادي در سيستم كيتهاي تجاري بكار رفته كه قادر به شناسائي :

1 - گنادوتروپين جفتي انسان طبيعي و شكسته نشده

2 - گنادوتروپين جفتي  شكسته شده و شكسته نشده

3 - گنادوتروپين جفتي  شكسته نشده و زنجيره آزاد بتا

4 - گنادوتروپين جفتي  شكسته شده و شكسته نشده و زنجيرة آزاد بتا

5 – همه نوع گنادوتروپين جفتي  بجز فرم فاقد قسمت انتهائي زنجيرة بتا

6 – كليه فرمهاي زنجيرة بتاي گنادوتروپين جفتي انسان است.

در اغلب بارداريهاي طبيعي فرمهاي مختلف گنادوتروپين جفتي انسان در سرم يا ادرار فقط بخش كوچكي از تمام هورمون را تشكيل مي‌دهند. اما در مراحل مختلف بيماريهاي تروفوبلاستي يا سرطاني، اين فرمها مي توانند بخش عمده اي را بخود اختصاص دهند.فرمهاي مختلف مذكور به سنتز و تجزية مولكول گنادوتروپين جفتي انسان بستگي دارد. اين هورمون گليكوپروتئيني است كه از سلولهاي تروفوبلاستي در طول بارداري در جفت ساخته مي شود. البته اين تركيب توسط همين نوع سلولها در مول هيداتيفرم، كوريوكارسينوما و تومور سلولهاي ژرمينال مانند سرطان بيضه، تومورهاي جفتي و يا تخمداني و برخي ديگر از بدخيمي‌ها توليد مي شود. مقدار كمي از گنادوتروپين جفتي انسان توسط هيپوفيز ساخته مي‌شود.

ميزان گنادوتروپين جفتي انسان در سلامت و بيماري

غلظت گنادوتروپين جفتي انسان در سرم زنان غير باردار بستگي به عملكرد گنادها دارد و در حوالي يائسگي  ميزان آن كمي افزايش مي‌يابد. براساس نوع كيت محدودة طبيعي آن كمي متفاوت است. بطور متوسط ميزان گنادوتروپين جفتي انسان در زنان غير باردار كمتر از 10 واحد بين‌المللي در ليتر مي‌باشد. ميزان اين هورمون در مردان كمتر از زنان غير باردار بوده و معمولاَ كمتر از 5 واحد بين‌المللي در ليتر است. در مردان بالاي 50 سال ميزان گنادوتروپين جفتي كمي بيشتر از سنين پائين‌تر است.  مقدار ميانة گنادوتروپين جفتي انسان و زنجيرة بتا در سرم و ادرار مشابه است ولي ميزان قطعه مركزي زنجيرة بتا در ادرار بيشتر از سرم است.

در زمان بارداري قطعه مركزي بتا از تجزيه گنادوتروپين جفتي و زنجيره بتا در كليه‌ها بوجود مي‌آيد. هر چند كه غلظت گنادوتروپين جفتي انسان و زنجيرة بتا در ادرار  زنان و مردان با افزايش سن بالا مي‌رود اما به اندازة افزايش سرمي آن نيست. غلظت قطعه مركزي زنجيره بتا در ادرار زنان و مردان تقريباَ يكسان است. پس از  زايمان طبيعي مقدار گنادوتروپين جفتي انسان كاهش مي‌يابد ، نيمه عمر كاهشي آن حدود 24 ساعت است و پس از يك تا سه هفته به مقدار طبيعي خود مي‌رسد. غلظت سرمي اين هورمون پس از سقط جنين در سه ماهة اول ظرف 4 تا 5 هفته به حد طبيعي خود باز مي گردد. غلظت متوسط زنجيرة بتا طي حاملگي 5/0 تا 6/1 درصد كل هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان را تشكيل مي‌دهد. ميزان قطعه مركزي بتا 03/0 درصد كل اين هورمون است. در حاليكه غلظت ادراري آن 4000 برابر غلظت سرمي آن است. قطعه مركزي زنجيره بتا مهمترين فرم اين هورمون در ادرار زنان حامله در ماه اول بارداري است.افزايش غلظت سرمي و ادراري با يكديگر  متناسب مي‌باشد. اعداد حاصل از اندازه گيري هورمون گنادوتروفين جفتي‌ تام انسان در ادرار احتمالاَ بطور عمده مربوط به زنجيره مركزي بتا است.

حدود 20 تا 25 درصد بارداري ها خودبخود سقط شده و معمولاَ تنها علامت حاملگي افزايش اين هورمون در سرم و ادرار است. اين شرائط را بارداري تحت باليني مي‌نامند. سقط خودبخود عمدتاَ در سه ماهة اول رخ    مي دهد. ابتدا ميزان اين هورمون بطور طبيعي افزايش يافته و ناگهان كاهش مي‌يابد. در حاملگي خارج از رحم غلظت اين هورمون در سرم كمتر از ميزان آن در بارداري طبيعي است.

غلظت هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان در سرم و ادرار فرد مبتلا به كوريوكارسينوم و مول بشدت افزايش مي‌يابد. در بيماري خوش خيم تروفوبلاستي، غلظت زنجيرة بتا كمتر از 5 درصد ميزان كل هورمون است.

حدود 50 درصد از سرطانهاي بيضه كه مربوط به لوله‌هاي اسپرم ساز نيستند، سبب افزايش (معمولاَ شديد) اين هورمون در سرم و ادرار مي‌شوند. هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان بندرت در سرطانهاي لوله‌هاي اسپرم‌ساز افزايش مي يابد و اگر چنين تومورهائي اين هورمون را بسازند عمدتاَ از نوع زنجيره بتا خواهد بود. بطور كلي هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان توسط سلولهاي غيرتروفوبلاستي ساخته نشده، اما مقدار كمي زنجيره بتا توليد مي‌شود. از آنجائيكه زنجيره بتا در بيماران مبتلا به سرطان در حد متوسطي بالا مي‌رود، زماني بعنوان شاخص مفيدي تلقي مي‌شود كه با روشهاي حساس اندازه‌گيري شود. البته با توجه به تجزيه شدن زنجيره بتا به قطعه مركزي بتا، اين جزء در ادرار چنين افرادي هم يافت مي‌شود.

محدوديتهاي آزمايشگاهي

انواع مولكولهاي هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان در خون و ادرار وجود دارند كه از نظر طول پلي‌پپتيد و ميزان قند متصل به آنها با هم متفاوت هستند. پزشكان هنگام درخواست آزمايش و متخصصين آزمايشگاه هنگام استفاده از روش هاي ايمونواسي مختلف بايد به نوع هورمون يا متابوليت مورد درخواست يا كيت مورد استفاده توجه داشته باشند، زيرا برخي از كيت ها تنها نوع كامل و بعضي ديگر علاوه بر نوع كامل زيرواحدبتا را نيز تعيين مي كنند. همانطور كه ذكر شد كيتهائي وجود دارندكه همه انواع هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان را اندازه‌گيري مي‌كنند. با وجود آنكه استفاده از همه انواع كيت هاي فوق در بارداري طبيعي بدون اشكال است در حاملگي هاي غير طبيعي(بارداري با سندرم داون، پره‌اكلامپسي، بيماريهاي تروفوبلاستي) نوع خاصي از كيت قابل استفاده است.  بعنوان مثال در مواردي كه تنها نوع هورمون گنادوتروفين جفتي‌ شكسته شده و يا تنها زيرواحد آزاد بتا در خون وجود دارد، استفاده از كيتي كه همة مواد را اندازه‌گيري مي كند پاسخگوي وضع بيمار نيست. بطور كلي امروزه توصيه مي‌شود كه بر روي كيت هاي مختلف علائم راهنمائي مناسب براي جلوگيري از سردرگمي آزمايشگاهيان نصب شود، همچنين در پايش يك بيمار بايد از يك روش بخصوص و يك آزمايشگاه استفاده شود و مقايسه نتايج آزمايشگاههاي مختلف كار صحيحي نيست.

گردآورنده و ویراستار: دکتر محمد قهری -آزمایشگاه فارابی اردبیل

منبع: هورمون گنادوتروفين جفتي‌ انسان در سلامتي و بيماري